AKNA Frameshift Variant in Three Dogs with Recurrent Inflammatory Pulmonary Disease

Majitelé psů si nedávno všimli několika úzce souvisejících dlouhosrstých kolií s recidivující plicní nemocí, která klinicky připomínala psí formy PCD. Cílem této studie bylo zjistit základní kauzativní genetickou vadu.
Tato studie zahrnovala 88 dlouhosrstých kolií. Tři příbuzné dlouhosrsté kolie, z nichž dvě byly nevlastní sourozenci, měly podle hlášení majitelů recidivující plicní onemocnění. Ostatních 85 psů bylo hlášeno jejich majiteli jako nedotčeno. Vzorky krve EDTA byly odebrány pro izolaci DNA. Použili jsme také 539 psů různých jiných plemen, jejichž vzorky byly darovány Vetsuisse Biobank (tabulka S1). Představovali populační kontroly bez hlášení recidivujících plicních nemocí.

Zkoumali jsme tři příbuzné dlouhosrsté kolie s recidivujícím zánětlivým plicním onemocněním. Klinické příznaky byly podobné jako primární ciliární dyskineze (PCD). Postižení psi však neměli žádné známé patogenní varianty PCD. Analýza rodokmenů odhalila recesivní režim dědičnosti. Kombinované mapování vazeb a homozygotnosti ve třech případech a sedmi neohrožených členech rodiny vymezilo 19 kritických intervalů na 10 chromozomech, což je celkem 99 Mb. Genom jednoho postiženého psa byl sekvenován a porovnáván s 601 kontrolními genomy. V kritických intervalech jsme detekovali pouze jednu soukromou variantu změny homozygotního proteinu. Detekovanou variantou byla delece 4 bp, c.2717_2720delACAG, v AKNA genu kódujícím AT-hook transkripční faktor. Způsobuje posun rámce zavedením předčasného stop kodonu a zkrátí 37% otevřeného čtecího rámce, str. (Asp906Alafs * 173). Genotypizovali jsme 88 dlouhosrstých kolií složených z rodinných příslušníků a nepříbuzných jednotlivců. Všechny tři dostupné případy byly homozygotní pro mutovanou alelu a všech 85 neovlivněných psů bylo buď homozygotní divoký typ (n = 67) nebo heterozygotní (n = 18). AKNA moduluje zánětlivé imunitní odpovědi. Myši Akna - / - knockout umírají krátce po narození v důsledku systémových autoimunitních zánětlivých procesů, včetně zánětu plic, který je doprovázen zvýšenou infiltrací leukocytů a alveolární destrukcí. Dokonalé spojení genotypu a fenotypu a srovnávací funkční údaje silně naznačují, že detekovaná varianta AKNA: c.2717_2720delACAG způsobila pozorovaný závažný zánět dýchacích cest u zkoumaných psů. Naše zjištění umožňují genetické testování, které lze použít k zamezení neúmyslného chovu postižených štěňat.
Zděděné formy recidivující pneumonie nebo zánětlivých onemocnění dýchacích cest jsou často způsobeny primární ciliární dyskinezí (PCD) u lidí a domácích zvířat. PCD je charakterizována ztrátou funkce pohyblivé řasinky, a to nejen v plicích, ale také v paranazálních dutinách, středním uchu, spermatu, ženském reprodukčním traktu a ependymu mozku. Porucha struktury nebo funkce řasinek obvykle vede k opakujícím se infekcím horních a dolních dýchacích cest. Základní patogeneze je snížená mukociliární clearance prachu a infekčních agens [1]. Je známo, že varianty u více než 40 genů způsobují PCD u lidí [2,3,4]. Příčinné genetické varianty PCD byly také hlášeny u čistokrevných psů. Varianty v CCDC39 [5] a NME5 [6] byly identifikovány u PCD postižených starých anglických ovčáků a Aljašských malamutů. I přes rozsáhlé znalosti o PCD existují klinicky popsané formy dědičných recidivujících zánětlivých onemocnění dýchacích cest u lidí a psů, jejichž základní genetická příčina je stále neznámá [7,8]. Změny řasinek mohou také vyplývat z onemocnění dýchacích cest a poté se nazývají sekundární ciliární dyskineze (SCD). Diskriminace PCD a SCD na základě klinických příznaků a / nebo patologických nálezů může být náročná a není ve veterinární medicíně běžně dostupná [9].
Extrakce DNA a genotypizace
Genomická DNA byla izolována z EDTA krve pomocí soupravy Maxwell RSC Full Blood Kit pomocí přístroje Maxwell RSC (Promega, Dübendorf, Švýcarsko). Deset dlouhosrstých kolií skládajících se ze 3 případů a 7 kontrolních psů z rozšířené rodiny bylo genotypováno na Illumina canine_HD BeadChips obsahující 220 853 markerů (Neogen, Lincoln, NE, USA).
Mapování vazeb a homozygotnosti
Pro parametrickou analýzu vazeb byla použita data genotypu 3 nepostižených rodičů, 2 postižených a 4 nezasažených potomků ve dvou vrzích. Při použití PLINK v 1.09 [10] byly vyloučeny markery, které nebyly informativní, umístily se na pohlavních chromozomech nebo chyběly u některého z devíti psů, obsahujících Mendelovy chyby nebo mající menší alelu <0,05. Konečný soubor dat obsahoval 65 446 markerů. Pomocí softwaru Merlin byla provedena parametrická vazebná analýza s použitím autozomálního recesivního dědičného modelu s plnou penetrací a frekvencí alely onemocnění 0,4 [11].
Pro mapování homozygotnosti byla použita data genotypu tří postižených psů. Volby --homozyg a --homozyg - group v PLINK byly použity k hledání rozšířených oblastí homozygotnosti> 1 Mb. Výstupní intervaly byly porovnány s intervaly od analýzy vazeb v tabulkách Excelu k nalezení překrývajících se oblastí. Surové genotypy jednořetězcových variant (SNV) jsou k dispozici v S1. Výstup mapování vazeb a homozygotnosti je uveden v tabulce S2.
Sekvenování celého genomu postižené dlouhosrsté kolie
Byla připravena DNA knihovna Illumina TruSeq bez PCR s velikostí inzertu 500 bp postižené dlouhosrsté kolie (CL013). Na přístroji NovaSeq 6000 (26,9 × pokrytí) jsme shromáždili 227 milionů párů na konci 2 × 150 bp. Mapování a zarovnání byly provedeny, jak je popsáno [12]. Sekvenční data byla uložena pod přístupovým studiem PRJEB16012 a přístupovým vzorkem SAMEA4867926 v Evropském archivu nukleotidů.
Volání variant
Volání variant bylo provedeno pomocí GATK HaplotypeCaller [13] v režimu gVCF, jak je popsáno [9]. Pro predikci funkčních efektů zvaných variant byl použit software SnpEff [14] spolu s uvolněním 105 anotací NCBI 105 pro referenční sestavu genomu CanFam 3.1. Pro filtrování variant jsme použili 601 kontrolních genomů, které byly buď veřejně dostupné [15], nebo byly vyrobeny během jiných projektů naší skupiny [16] (tabulka S3).
Genová analýza
Pro všechny analýzy jsme použili sestavu referenčního genomu psa CanFam 3.1. Číslování v psím genu AKNA odpovídá NCBI RefSeq přístupům XM_014117950.2 (mRNA) a XP_013973425.1 (protein).
Sekvenování Sangerů
Varianta AKNA: c.2717_2720delACAG byla genotypována přímým Sangerovým sekvenováním PCR amplikonů. 305 bp (nebo 301 bp pro deleční alelu) PCR produkt byl amplifikován z genomické DNA pomocí AmpliTaqGold360Mastermix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) společně s primery 5'-CCT GTG AGC CTC TGG AAT GT-3 '(Primer) F) a 5'-CTG AGA ATG CCC AGA CCA TC-3 '(primer R). Po ošetření exonukleázou I a alkalickou fosfatázou byly amplikony sekvenovány na analyzátoru ABI 3730 DNA (Thermo Fisher Scientific). Sangerovy sekvence byly analyzovány pomocí softwaru Sequencher 5.1 (GeneCodes, Ann Arbor, MI, USA).

Výsledky

Popis fenotypu
Majitelé hlásili opakované pěnivé zvracení, mělké dýchání, kašel, zvýšené dýchací zvuky, výtok z nosu a horečku ve třech souvisejících případech dlouhosrstých koliích. Bronchopneumonii diagnostikoval soukromý veterinární lékař. Klinické příznaky začaly u několika postižených psů ve věku několika dnů. Psi reagovali na terapii antibiotiky a sekretolytiky. Měli však tendenci rychle se recidivovat. U dvou psů bylo hlášeno, že žijí tři roky s častým nažloutlým výtokem z nosu. U třetího postiženého psa nejsou k dispozici žádné informace o průběhu onemocnění.
Genetická analýza
Byly hlášeny tři související případy. Rodokmen těchto psů je znázorněn na obrázku 1 a je navržena autosomálně recesivní dědičnost. Analýza spojení pomocí dvou vrhů se šesti potomky (dva postižení, čtyři nezasažení) a jejich tří rodičů ukázaly 18 spojených genomových segmentů v celkovém množství 246 Mb. U tří postižených psů jsme navíc provedli mapování homozygotnosti. Sdíleli 87 homozygotních segmentů se stejnými alelami v celkovém objemu 354 Mb. Průnik propojených a homozygotních oblastí vymezil kritické intervaly obsahující 19 segmentů na 10 chromozomech překlenujících 99 Mb nebo zhruba 4,1% psího genomu 2,4 Gb. Dvě známé psí příčinné varianty PCD, CCDC39: c.286C> T [5] a NME5: c.43delA [6], nebyly lokalizovány v kritických intervalech a mohly být proto vyloučeny.

Obrázek 1

Rodokmen tří vyšetřovaných případů. Vyplněné symboly představují psy s opakujícím se zánětlivým plicním onemocněním. Otevřené symboly představují nepostižené psy. AKNA: c.2717_2720delACAG genotypy jsou indikovány pro všechny psy, z nichž byl k dispozici vzorek DNA. Laboratorní identifikátory 10 psů, kteří byli genotypováni na SNV mikročipu pro mapování vazeb a homozygotnosti, jsou podtrženi. Šedý obdélník označuje 9 psů, kteří byli použiti pro analýzu vazeb.

Při 26,9 × pokrytí jsme sekvenovali genom postiženého psa a nazvali jsme SNV a krátké indely s ohledem na sestavu genomu CanFam3.1. Poté jsme hledali soukromé homozygotní varianty v genomové sekvenci postiženého psa, které nebyly přítomny u 601 kontrolních psů různých plemen (tabulka 1). V kritických intervalech jsme identifikovali pouze jednu soukromou variantu změny homozygotního proteinu (tabulka S4).

Výsledky filtrování variant u postiženého psa a 601 kontrolních genomů.
Homozygotní varianty filtračního kroku
varianty v celém genomu 3 378 300
soukromé varianty v celém genomu 1332
soukromé varianty proteinových změn v celém genomu 7
soukromé varianty měnící protein v kritických intervalech 1

Tato varianta představovala deleci 4 bp, kterou lze označit jako Chr11: 68 576 241_68 576 244delCTGT (sestava CanFam 3.1). Byla lokalizována v AKNA genu kódujícím AT-hook transkripční faktor a předpokládá se, že povede k posunu rámců kódující sekvence, XM_014117950.2: c.2717_2720delACAG. Varianta zavádí předčasný stop kodon. Kvůli nedostatku vhodných vzorků RNA jsme experimentálně nezkoumali, zda mutantní transkripty podléhají nezmyslově zprostředkovanému rozpadu a / nebo nezmysly zprostředkovaným alternativnímu sestřihu. Pokud je exprimován, předpokládaný produkt translace mutantního transkriptu by postrádal 529 aminokyselin proteinu AKNA s 1434 aminokyselinami a obsahoval 172 nových aminokyselin na svém C-konci. Formální variantní označení je XP_013973425.1: s. (Asp906Alafs * 173). Potvrdili jsme přítomnost varianty AKNA: c.2717_2720delACAG ve vzorcích genomické DNA sekvencí Sanger (obrázek 2).
Obrázek 2

Podrobnosti o variantě AKNA: c.2717_2720delACAG. Jsou zobrazeny reprezentativní elektroferogramy kontroly a postiženého psa. Čtyři vymazané báze jsou označeny čtvercem. Změněné translace aminokyselin jsou znázorněny červeně.

Pro tuto variantu jsme genotypizovali celkem 627 psů a pozorovali jsme perfektní shodu genotyp-fenotyp (tabulka 2). Všechny tři postižené dlouhosrsté kolie provedly deleci v homozygotním stavu. Osmnáct nezasažených psů bylo heterozygotních a předpokládaných nositelů. Zbývajících 67 neovlivněných dlouhosrstých kolií bylo homozygotním divokým typem. Protože jsme testovali pouze relativně malý počet dlouhosrstých kolií, včetně mnoha blízkých příbuzných postižených psů, nemůžeme spolehlivě odhadnout frekvenci alel v plemeni. Mutantní alela u varianty AKNA: c.2717_2720delACAG chyběla u 539 dodatečně genotypizovaných psů různých plemen (tabulka S1).

Asociace genotypu a fenotypu varianty AKNA: c.2717_2720delACAG.
Psi wt / wt wt / del del / del
Případy, dlouhosrsté kolie (n = 3) 0 0 3
Kontroly, dlouhosrsté kolie (n = 85) 67 18 0
Kontroly, různá plemena psů (n = 539) 539 0 0

V této studii jsme identifikovali AKNA: c.2717_2720delACAG jako kandidátní kauzativní variantu zděděné formy recidivujícího zánětlivého plicního onemocnění u psů. Postižení psi byli původně podrobeni podezření na diagnózu PCD. Byli jsme proto překvapeni, že se ukázalo, že kandidátská kauzativní varianta nesouvisí s cilaiální funkcí. Klinický fenotyp dosud nebyl podrobně charakterizován. Předpokládáme termín opakující se zánětlivé plicní onemocnění, abychom zdůraznili fenotypové podobnosti postižených psů u myší Akna - / - knockout (viz níže).

AKNA kóduje transkripční faktor AT-hook, který má důležitou regulační funkci v imunitním systému. Moduluje transkripci CD40 a jeho ligandu CD154 (nazývaného také CD40L) v imunitních buňkách [17]. Ukázalo se, že interakce CD40 a CD154 se podílí na negativní regulaci autoreaktivity T buněk a abnormality v jejich interakci mohou vést k autoimunitě. U lidských systémových autoimunitních chorob, jako je Vogt-Koyanagi-Harada syndrom, bylo zjištěno, že AKNA je downregulována v CD4 + T-lymfocytech [18]. Dále byly hlášeny asociace mezi variantami genu AKNA s osteoartrózou kolene [19] a zvýšeným rizikem rakoviny děložního čípku v důsledku deregulace v zánětlivé síti [20,21]. Podle našich nejlepších znalostí nebyl ve vědecké literatuře popsán žádný lidský pacient postižený opakujícím se zánětlivým plicním onemocněním nebo jinou patologií s variantami zárodečného kódování v AKNA. Údaje od více než 120 000 lidí v prohlížeči gnomAD [22] ukazují, že ztráty funkce AKNA (LoF) jsou méně časté, než se očekávalo (19 pozorovaných vs. 61,4 teoreticky očekávaných variant LoF). Dosud nebyli identifikováni jedinci nesoucí variantu AKNA LoF v homozygotním stavu.

Myši Akna - / - knockout jsou menší než jejich vrhu vrhů divokého typu a umírají do 10 dnů po narození v důsledku systémového zánětu, zejména v plicích [23]. Zvýšená infiltrace leukocytů a masivní nadprodukce prozánětlivých cytokinů a matričních metallproteináz vedou k alveolární destrukci u myší s knockoutem Akna - / -. Myší gen Akna obsahuje 22 exonů a byly zkoumány dva různé knockoutové kmeny. Počáteční kmen byl vytvořen delecí exonů 19–21. Nebylo hodnoceno, zda v tomto konkrétním kmeni může být exprimován protein zkrácený na C-konci [23]. Tento knockout kmen se podobá situaci v homozygotním mutantu dlouhosrstých kolií, který má posun čtecího rámce počínaje exonem 13. Později byl zkonstruován druhý knockoutový kmen myši s delecí exonu 3. Exon 3 je největší kódovací exon a kóduje první AT-hook motiv AKNA. Oba knockoutované kmeny Akna - / - myši vykazovaly srovnatelné fenotypy [23].

Genetická vyšetření u psů ukázala perfektní korelaci genotyp-fenotyp varianty AKNA s recidivujícím zánětlivým plicním onemocněním. Toto sdružení podporuje příčinnou roli AKNA: c.2717_2720delACAG, nemůže však poskytnout definitivní důkaz. Známá role AKNA jako důležitého protizánětlivého regulátoru imunitní odpovědi a výrazných fenotypových podobností postižených psů u myší Akna - / - knockout v kombinaci s genetickou asociací však silně naznačuje, že AKNA: c.2717_2720delACAG je příčinná varianta.

Identifikovali jsme AKNA: c.2717_2720delACAG jako kandidátní kauzativní variantu pro dědičné, autosomálně recesivní, recidivující zánětlivé plicní onemocnění u dlouhosrstých kolií. Zjištění z knockoutovaných myší a těchto psů naznačují, že AKNA by měla být považována za kandidátní gen pro lidské pacienty s nevysvětlitelným opakujícím se zánětlivým plicním onemocněním. Naše zjištění umožnila genetické testování u dlouhosrstých kolií, které lze použít k zamezení neúmyslného chovu postižených štěňat.

Poděkování

Autoři jsou vděční majitelům psů, kteří darovali vzorky a sdíleli údaje o zdraví a rodokmenu svých psů. Děkujeme Evě Andristové, Nathalie Besuchet Schmutz, Muriel Fragnière a Sabrina Schenk za odbornou technickou pomoc, Sekvenční platformě příští generace University of Bern za provedení vysoce výkonných sekvenčních experimentů a Interfaculty Bioinformatics Unit of University of Bern za poskytování vysoce výkonné výpočetní infrastruktury. Děkujeme konsorciu databáze biomedicínských variant psů (Gus Aguirre, Catherine André, Danika Bannasch, Doreen Becker, Brian Davis, Cord Drögemüller, Kari Ekenstedt, Kiterie Faller, Oliver Forman, Steve Friedenberg, Eva Furrow, Urs Giger, Christophe Hitte, Marjo Hytnen , Vidhya Jagannathan, Tosso Leeb, Hannes Lohi, Cathryn Mellersh, Jim Mickelson, Leonardo Murgiano, Anita Oberbauer, Sheila Schmutz, Jeffrey Schoenebeck, Kim Summers, Frank van Steenbeek, Claire Wade) za sdílení celých genomových sekvenčních dat od kontrolních psů. Uznáváme také všechny psí vědce, kteří ukládali data o sekvenování celého genomu psa do veřejných databází.
Financování
Tento výzkum neobdržel žádné externí financování.
Střet zájmů
A.K. je zaměstnancem společnosti Laboklin, která nabízí genetické testování pro psy.